Kính hiển vi quang học – Nguyên lý và cấu tạo

1. Giới thiệu chung

 

Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được. Khoa học nhằm khám phá và kiểm tra những vật thể nhỏ nhờ một thiết bị như vậy được gọi là khoa học hiển vi (microscopy). Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính). Khả năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải.

 

Năm 1590, hai cha con thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen và Zaccharias Janssen đã phát minh ra kính hiển vi đầu tiên. Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 - 1732), Hà Lan, là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi khuẩn, tinh trùng và các vi sinh vật trong nước... Từ đó, rất nhiều khám phá và công trình nghiên cứu được công bố, Anton van Leeuwenhoek được coi là “Cha đẻ của khoa học hiển vi – Father of Microscopy) cho dù ông chưa từng được học qua trường lớp nào. Robert Hook (1635 – 1703) đã sử dụng nguồn sáng để quan sát thế giới vi sinh vật bằng kính hiển vi, ông cũng chính là người đầu tiên quan sát được cấu trúc tế bào. Cuốn sách “Hình ảnh hiển vi” được xuất bản năm 1665 đã mô tả rất nhiều đối tượng mà mắt thường không nhìn thấy được. Ông cũng được tôn vinh là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh”.

 

Trong những thập kỷ gần đây, nhờ sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, các thế hệ kính hiển vi hiện đại liên tục được giới thiệu và tung ra thị trường với nhiều tính năng ưu việt. Do vậy, rất khó để phân ra chính xác thành từng loại kính hiển vi. Tuy nhiên, một số nhóm kính hiển vi có thể được tóm lược như sau: kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi phản pha, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ,…), kính hiển vi điện tử (kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM, kính hiển vi điện tử quét - SEM,…), kính hiển vi quét đầu dò (kính hiển vi lực nguyên tử -  AFM, kính hiển vi quét chui hầm -  STM, kính hiển vi quang học quét trường gần – SNOM,…)

 

Bài này chỉ tập trung giới thiệu một số loại kính hiển vi quang học được sử dụng phổ biến tại các phòng xét nghiệm vi sinh ở Việt Nam.

 

Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (transmitted light microscope) là loại kính hiển quang học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, thường sử dụng một nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặt trên một lam  kính  để quan sát hình dạng và vi cấu trúc của mẫu. Ảnh của mẫu là hình ảnh hai chiều.

 

Kính hiển vi soi nổi (stereoscopic microscope) là loại kính hiển vi quang học được thiết kế để quan sát hình ảnh bề mặt của mẫu vật thể ở độ phóng đại thấp. Loại kính này thường sử dụng chùm  ánh sáng trắng chiếu tới bề mặt của vật thể, hình ảnh tạo ra bởi ánh sáng phản xạ thông qua hai trục quang học riêng biệt với hai vật kính (hoặc một vật kính phẳng), hệ thống kính phóng và đến thị kính,. Ảnh của mẫu vật thường là hình ảnh 3 chiều.

 

Kính hiển vi phân cực (polarizing microscope) là loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng phân cực để quan sát, nghiên cứu định tính và định lượng những mẫu có đặc tính lưỡng chiết (có hai chỉ số khúc xạ). Kính hiển vi phân cực có khả năng cung cấp những thông tin về màu hấp thụ và đường biên quang học giữa các chất liệu khác nhau (có chỉ só khúc xạ khác nhau) trong cùng một mẫu. Hình ảnh hiển vi phân cực có độ tương phản cao.

 

Kính hiển vi quang học có hai nicon phân cực ánh sáng, đặt thẳng góc nhau: nicon phân cực đặt dưới mâm kính, nicon phân tích đặt giữa vật kính và thị kính. Mẫu đá hoặc khoáng vật mài mỏng tới bề dày 0,03 mm, được gắn bằng nhựa Canađa vào tấm thuỷ tinh và đặt trên mâm kính. KHVPC cho phép xác định các hằng số quang học của khoáng vật (chiết suất, lưỡng chiết suất, góc quang học, màu tự nhiên, màu đa sắc của khoáng vật kim loại) và nhờ đó có thể xác định chính xác tên khoáng vật.

 

Kính hiển vi huỳnh quang (flourescence microscope) là loại kính hiển vi quang học sử dụng một nguồn ánh sáng kích thích để nghiên cứu, quan sát các thuộc tính của mẫu sinh học sau khi mẫu này nhuộm với chất phát huỳnh quang (hoặc mẫu tự phát huỳnh quang). Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang cũng cho phép quan sát những thuộc tính sinh hóa và sinh lý học của các tế bào sống. Phụ thuộc vào mục đích và đối tượng cần quan sát mà mẫu có thể nhuộm với những chất phát huỳnh quang khác nhau sử dụng ánh sáng có bước sóng kích thích khác nhau. 

 

 

2. Cấu tạo

2.1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua

 

Gồm các bộ phận chủ yếu sau:

- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen).

- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng (nếu có)

- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)

- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)

- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát

- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.

- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.

- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)

- Ống nối với camera (nếu có).

 

 

 Hình 1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (Leica DM3000 LED)

 

2.2. Kính hiển vi soi nổi

 

Gồm các bộ phận chủ yếu sau :

- Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua)

- Bệ kính giữ thăng bằng có giá đặt mẫu

- Lăng kính

- Ống quan sát

- Vật kính : thường bao gồm hai vật kính hoặc vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật ở các góc độ khác nhau. Độ phóng đại điển hình của vật kính : 1x ; 1,5x ; 2x.

- Núm chỉnh độ phóng đại

- Núm chỉnh độ hội tụ

- Thị kính : là một ống hình trụ mang thấu kính. Độ phóng đại điển hình của thị kính : 10x, 15x, 20x và 30x

- Ống nối camera (nếu có)

 

 

Hình 2. Cấu tạo của kính hiển vi soi nổi (Leica EZ4)

 

 

 2.3. Kính hiển vi phân cực

 

Gồm các bộ phận chủ yếu sau :

- Nguồn sáng (sợi đốt, halogen…)

- Tụ quang

- Bộ phân cực ánh sáng (thường được lắp cố định phía dưới tụ quang)

- Giá đỡ mẫu có khả năng xoay vòng

- Mâm vật kính

- Bộ phân tích (có khả năng xoay vòng với góc đọc nhỏ)

- Vật kính: là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình khác nhau như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.

- Thị kính: là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x.

- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô, chỉnh tinh)

- Bệ đỡ kính

- Ống nối với camera (nếu có)

 

Kính hiên vi soi ngược

 

Hình 3. Kính hiển vi phân cực (Leica DM4 M & DM6 M)

 

 2.4. Kính hiển vi huỳnh quang

 

Gồm các bộ phận chủ yếu sau :

- Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt hoặc halogen)

- Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)

- Tụ quang để hội tụ chùm sáng

- Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng

- Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)

- Giá đỡ mẫu (có bộ phận giữ mẫu)

- Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái)

- Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát.

- Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính.

- Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 2x, 5x, 10x

- Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô và chỉnh tinh)

- Ống nối với camera

 

 

Hình 4. Kính hiển vi huỳnh quang (Leica DM6 FS)

 

 

3. Nguyên lý hoạt động

3.1. Kính hiển vi ánh sáng truyền qua

 

 

Hình 5. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi ánh sáng truyền qua

 

Ánh sáng khả kiến từ nguồn được tập trung lại khi đi qua tụ quang để truyền qua mẫu đặt trên lam kính. Sau đó, ảnh của mẫu được tạo thành và phóng đại lần thứ nhất nhờ một thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi là vật kính. Hình ảnh này có thể tiếp tục được phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng. Hình ảnh phóng đại cuối cùng của mẫu là ảnh thật, quan sát được nhờ thị kính (có tiêu cực dài hơn rất nhiều so với tiêu cự của vật kính) hoặc được ghi lại nhờ CCD camera. Độ phân giải của ảnh hiển vi quang học bị hạn chế bởi nhiễu xạ. Theo công thức của Abbe – Rayleigh, khoảng cách nhỏ nhất dmin giữa hai điểm có khả năng phân biệt được tính theo công thức:

 

dmin = 1,22l/2NA

 

 trong đó l là bước sóng ánh sáng, NA = n x sinα được gọi là khẩu độ số của vật kính, n là chiết suất của môi trường mẫu quan sát, α là bán góc mở cực đại của vật kính khi quan sát mẫu.

 

3.2. Kính hiển vi soi nổi

 

 

Hình 6. Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi soi nổi